研究背景

抗體偶聯(lián)藥物（ADC，Antibody-drug conjugates），是將類似于化療的細(xì)胞毒性藥物與單克隆抗體連接在一起，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的靶向殺傷功能。其結(jié)合了靶向療法和化療療法的作用原理，具有靶向性高，特異性強(qiáng)，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。

早在2015年，Jones團(tuán)隊(duì)利用流動(dòng)化學(xué)實(shí)現(xiàn)通過小分子標(biāo)簽加工蛋白質(zhì)(包括抗體)的可行性，并成功地利用直接的一步生物偶聯(lián)天然賴氨酸側(cè)鏈，對蛋白質(zhì)和抗體進(jìn)行修飾。（ 請參考：J. Flow Chem. 2015, 5, 151-154)

但在ADC中，由于抗體中有超過80個(gè)暴露的且具備反應(yīng)活性的賴氨酸殘基。如此多的活性位點(diǎn)會(huì)使得偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生多種偶聯(lián)混合物。ADC的連續(xù)化合成目前未見有報(bào)道。

結(jié)合之前Jones的工作，研究者決定嘗試以連續(xù)流反應(yīng)器合成ADC。

ADC合成概述

通過半胱氨酸等內(nèi)源性氨基酸，在二硫鍵間的連接位點(diǎn)合成ADC是一種常見的方法。這種偶聯(lián)方法需要對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行氧化還原，以釋放活性硫醇部分。

該生物偶聯(lián)過程可分為兩個(gè)步驟: 通過三（2-羧乙基）膦（TCEP）還原抗體，然后巰基與馬來酰亞胺藥物偶聯(lián)（如圖1）。

圖1. 半胱氨酸基ADC的合成方案

這種偶聯(lián)技術(shù)具有優(yōu)勢，因?yàn)槠淇刂频乃幬?抗體比（DAR）（典型DAR值在3.5 - 8之間）和相對較低的異質(zhì)性，目前主要使用傳統(tǒng)的間歇反應(yīng)器進(jìn)行合成。

作者使用連續(xù)流反應(yīng)器和傳統(tǒng)的含馬來酰亞胺藥物連接劑生產(chǎn)ADC，開發(fā)出一種連續(xù)制備9個(gè)半胱氨酸偶聯(lián)ADC的工藝（圖2），在幾分鐘內(nèi)從天然抗體實(shí)現(xiàn)ADC合成，且所得ADC的目標(biāo)DAR和聚集特性與市售ADC相似。

一. 連續(xù)流工藝

作者基于之前使用連續(xù)流反應(yīng)器的經(jīng)驗(yàn)，此次使用的是V型混合器+管式反應(yīng)器。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，除了考量反應(yīng)時(shí)間和溫度，管式反應(yīng)器的長度也是此次工藝優(yōu)化的關(guān)鍵變量。

圖2. 連續(xù)流合成流程圖

管式反應(yīng)器的長度直接影響反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)器1用于TCEP還原，反應(yīng)器2用于藥物偶聯(lián)。  因此，作者評估了反應(yīng)器長度和產(chǎn)生的ADC的 DAR之間的關(guān)系（表1）。

在初步可行性研究中，作者選擇曲妥珠單抗（Trastuzumab）和藥物連接劑MMAE進(jìn)行偶聯(lián)。通過反相高效液相色譜(RP)分析，將間歇反應(yīng)器和連續(xù)流法生產(chǎn)的ADC進(jìn)行了直接比較。

表1. 間歇式反應(yīng)器和連續(xù)化反應(yīng)結(jié)果比對

二. 工藝條件研究

• 在間歇法的生物偶聯(lián)中，通常需要超過1小時(shí)的時(shí)間來完成ADC偶聯(lián)步驟。

• 而使用管式反應(yīng)器，在37℃下進(jìn)行3min TCEP還原，然后在25℃下偶聯(lián)藥物 3min，得到的ADC的測量DAR值為3.2（表1，條目1）。

• 當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間降低到1.5 min時(shí)，得到的ADC的DA值R沒有變化（表1，條目2）。

• 偶聯(lián)時(shí)間進(jìn)一步降低到0.75 min也沒有顯著降低，但將Reactor-2停留時(shí)間降低到0.38 min，得到的ADC的DAR值小于2。

• 還原步驟（Reactor-1）的時(shí)間從3min減少到1.5min也導(dǎo)致ADC的DAR值小于2。

三. 反應(yīng)底物的拓展

作者進(jìn)一步評估了其他抗體和藥物連接子，以驗(yàn)證連續(xù)流化學(xué)方法合成ADC的普遍性和可靠性。

如表2所示：通過連續(xù)流反應(yīng)器，作者制備9個(gè)半胱氨酸偶聯(lián)ADC，都取得了不錯(cuò)的結(jié)果。

表2. 底物拓展研究實(shí)驗(yàn)